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01—磁珠运输法提取DNA微米级的磁珠同微珠作用一样，其大比表面积能够提升DNA扩散至固相表面的传质效率，因此利用磁珠法提取DNA其主要步骤包括：（1）磁珠被外部的磁场固定在某一特定位置，然后去除磁场用试剂重悬清洗干净；（2）磁珠通过外部磁场的相对运动，运输至其他试剂中浸润；（3）表面DNA洗脱以后，磁珠被磁场吸附至试剂液面以上，防止影响后续实验操作。
磁珠法提取DNA通常基于移液工作站或是微流体平台实现，同时也可以采用离心微流控的方式02—样本类型取Listeria innocua 采用25 mL的脑心浸液（BHI）在37℃条件下配制，并使用200rpm搅拌均匀。
随后用10倍的稀释倍数稀释至8.5×108cfu/mL左右的细胞浓度然后使用1.5 mL的配制的细胞培养储备液和50uL的蛋白酶K、1.5mL的裂解-结合液混合，放置于56℃，1200rpm条件下孵育20 min。
最后取200ul的裂解样本和5uL浓度为3500 copies/uL的lambda phage DNA内标混合制成纯化样本03—芯片实验平台磁珠法提取DNA的离心微流控芯片使用PDMS吹塑工艺制成，直径130mm，并使用压敏胶封装。
芯片包含五个储液腔（i1~i5），三个混合腔（chamber1~3，腔室体积分别对应250uL，130uL，50uL），以及一个处于下游位置的收集腔（Downstream fluidics），如图 1a所示。
三个混合腔独立分布在芯片等径向的位置上，上游分别连接储液腔i1~i5（i1：已裂解样本102.5uL；i2: 50%（v/v）异丙醇50uL；i3:已裂解样本102.5uL；i4：清洗液2, 130uL；i5：PCR级纯水），相互之间通过靠近中心腔室顶侧位置的管路结构联通，管路足够宽且有空气间隙，作为运输磁珠的通道。
腔室表面取用2 ×100 uL 0.5% (w/w)的 Teflon AF (DuPont, USA)溶液进行疏水处理（溶解于FluorinertFC 77）排气管路和储液腔之间使用0.2 uL包含0.5%(w/w)炭黑的特氟龙溶液镀膜，防止液体通过。
提取流程如图1b~f所示：1.600rpm持续15s，样本和结合液在腔室1混合，清洗液2进入腔室2中，洗脱液进入腔室3中；2.480rpm持续2s，磁珠颗粒再悬浮；3.120rpm持续10s，使磁珠吸附至内侧径向位置，随后增加转速至480rpm持续10s，磁珠在离心力作用下重新进入腔室底部，重复步骤30次，使DNA充分吸附至磁珠表面；
4.停止芯片转动，持续20s，使芯片停在特定位置，同时磁铁将吸附DNA的磁珠提出液面；5.芯片相对磁铁位移0.5°角度增量，过程持续1s，并退回至原有位置重复该步骤30次，保证磁珠能够完全从腔室1中抽离；
6.480rpm持续15s，磁珠由于离心力作用进入腔室2中清洗；7.再次将芯片停在指定位置，将磁珠从清洗液中提出，然后重复30次，最后移动至0.5°的洗脱液上方；8.480rpm持续15s，磁珠由于离心力作用进入腔室3中洗脱；
9.最后离心使洗脱液进入下游的收集腔中，并用注射器提出备用。
图 1. 芯片结构和磁珠法提取流程芯片放置于旋转电机上，其最大离心转速为7800rpm，最小的旋转分辨角度为0.025°三种钕铁硼磁铁堆叠放置于芯片腔室对应位置的上方（处于芯片径向距离r=36mm位置，与液面径向距离差为i=2.5 mm，与腔室之间的间距为d=0.5 mm）。
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整个芯片提取的过程中，磁铁的位置保持不变磁珠转移的初始状态下，磁铁对应腔室1的位置，磁珠受磁力作用形成团簇并离开气液界面进入腔室1和腔室2的联通管道中，然后芯片旋转0.5°增量，使得磁铁相对于芯片到达腔室2入口的上方，然后旋转芯片使磁珠在离心力作用下进入腔室2，磁珠进入腔室3的原理相同。
磁珠采用二氧化硅镀膜
图 2. 磁铁安装示意图（a）以及实体图（下a，b）04—磁场磁珠运输物理模型如图 1c所示，磁珠在腔室1中时作为计算的初始状态，磁铁吸附磁珠的磁力需要克服表面张力，已知磁珠的体积，磁珠磁化率和液体的磁化率（这里由于水的磁化率很小可以忽略不计），磁场强度和梯度(grad(B))·B，真空磁导率μ0，则有方程：
图3. 磁场作用于磁珠的力（b）以及x轴方向的磁场力（c）由于磁场强度作用于磁珠的合力方向为x轴，因此仅需考虑x轴的磁场强度和梯度的分量，具体受力如图 3所示因此公式1可以写成：其表面张力有公式：其中为液体的表面张力，试验的液体为水。
计算示例中磁铁的边长为7 mm，底部有两块直径为3mm，厚度为1mm的小磁铁以下是计算参数列表：a：分析天平，b：振动试样磁力计，c：特斯拉计05—结果分析采用纯水作为试剂的替代，计算磁珠从腔室1转移至腔室3的收集率，根据实验结果，82.6%±3.6%的磁珠能够被成功回收。
提取实验平行三次，每次使用新芯片，洗脱后的50uL洗脱液取1uL用于PCR扩增Listeria innocua的DNA回收率相对于试剂盒提纯方法在29 ± 25%至68 ± 24%之间lambda phage DNA内标的回收率相对于试剂盒提纯方法在43±10%之间。
为了在同张芯片上集成细胞裂解过程，设计200uL的样本进入和最终100uL的洗脱DNA样本取出，设计了如图4所示的芯片结构：
图 4. 集成裂解和提纯的芯片结构提取的整个流程分为裂解过程，结合过程，两次清洗过程以及洗脱过程，其中清洗液500ul，裂解液300uL，结合液450uL其与原有芯片的主要区别是——在结合液腔下游引入一个虹吸阀。
首先芯片以10Hz的速度将样本和除结合液以外所有提取试剂甩入对应腔室，使样本腔室1中裂解（降低转速至6Hz然后提升至10Hz，充分混合）然后停止芯片，接着提升至17Hz，使结合液进入腔室1，与已裂解样本结合。
芯片提取方法对格兰阳性和格兰阴性菌（B. subtilis和E. coli）进行DNA提取，结果是B. subtilis提取效率为标准的58.2–98.5%，E. coli为标准的45.3–102.1%。
参考文献：1. Strohmeier O, Emperle A, Roth G,et al. Centrifugal gas-phase transition magnetophoresis (GTM)–a generic methodfor automation of magnetic bead based assays on the centrifugal microfluidicplatform and application to DNA purification[J]. Lab on a Chip, 2013, 13(1):146-155.
2. Strohmeier O, Keil S, Kanat B, et al.Automated nucleic acid extraction from whole blood, B. subtilis, E. coli, andRift Valley fever virus on a centrifugal microfluidic LabDisk[J].RSC Advances, 2015, 5(41): 32144-32150.
（编者注：深圳市呈晖医疗科技有限公司是深圳市刚竹医疗科技有限公司全资子公司呈晖医疗团队一直以来专注于研发基于微流控的全自动核酸检测系统，以解决当前核酸检测的痛点注册此公众号主要分享团队对于微流控技术以及IVD行业的认识，欢迎关注。
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